重組慢病毒包裝服務

慢病毒服務簡介:

慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉染的細胞， 如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉導效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細胞基因組的兒率大大增加，能夠比較方便快捷地實現目的基因或目的shRNA的長期、穩定表達。

慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。所以，在體外實驗及體內實驗的研究中，慢病毒己經成為表達外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一， 并且正在獲得越來越廣泛的應用。

服務價格及周期:

編號	表達基因或shRNA	滴度	價格	周期
MBD-001	表達基因（<2K）	1×108?TU	3000元	3~4周
MBD-002		2×108?TU	4500元	3~4周
MBD-003		其他	詢價	3~4周
MBD-004	表達基因（2K~3K）	1×108?TU	4000元	3~4周
MBD-005		2×108?TU	6000元	3~4周
MBD-006		其他	詢價	3~4周
MBD-007	表達shRNA（單條）	1×108?TU	3000元	3~4周
MBD-008		2×108?TU	4500元	3~4周
MBD-009		更高滴度	詢價	3~4周
MBD-010	表達shRNA（三條，保證至少一條有效）	1×108?TU	10000元	3~4周
MBD-011		更高滴度	詢價	3~4周

備注：以上價格僅僅是病毒包裝的價格，不包含基因和載體構建的費用。

慢病毒對照價格及周期:

編號	服務內容	滴度	服務價格(元)	服務周期
MBD-012	綠色熒光；表達基因用對照	l x108TU	1500	現貨
MBD-013		2×108TU	2500	現貨
MBD-014		更高滴度	詢價	2-3周
MBD-015	紅色熒光；表達基因用對照	l x108TU	1500	現貨
MBD-016		2×108TU	2500	現貨
MBD-017		更高滴度	詢價	2-3 周
MBD-018	綠色熒光；表達shRNA用對照	l x108TU	1500	現貨
MBD-019		2×108TU	2500	現貨
MBD-020		更高滴度	詢價	2-3周

慢病毒包裝系統組成:

慢病毒包裝系統一般由慢病毒表達載體和慢病毒包裝載體組成。慢病毒表達載體，即通常所說的穿梭載體，包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。而慢病毒包裝質?？商峁┧械霓D錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝， 包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染?，F在的慢病毒包裝系統一般都是三質?；蛩馁|粒包裝系統。其中四質粒系統比三質粒系統在生物安全性上更好一些，所以應用較多。

慢病毒包裝系統載體選擇:

目前市面上常見的商業化慢病毒包裝系統較多，其中常用的有Clontech 、Invitrogen 等公司的相關產品。本公司通過大量實驗摸索，博采眾家之長，建立起了一套穩定、可靠、高效的慢病毒包裝系統。這套慢病毒包裝系統， 其穿梭載體主要來自Clontech公司，包括以下載體：

載體名稱	出品公司	用途	啟動子	熒光標記	真核篩選標記
pLVX-DsRed-Monomer-Nl	Clontech	表達基因	CMV	紅色熒光	Puro
pLVX-AcGFPI-N1	Clontech	表達基因	CMV	綠色熒光	Puro
pLVX-IRES-tdTomato	Clontech	表達基因	CMV	紅色熒光	無
pLVX-lRES-ZsGreen1	Clontech	表達基因	CMV	綠色熒光	無
pLVX-lRES-Neo	Clontech	表達基因	CMV	無	Neo
pLVX-lRES-puro	Clontech	表達基因	CMV	無	Puro
pLVX-shRNA1	Clontech	表達shRNA	hU6	無	Puro
pLVX-shRNA2	Clontech	表達shRNA	hU6	綠色熒光	無

轉染了紅色熒光蛋白載體或綠色熒光蛋白載體24小時后的病毒包裝293-t細胞熒光顯微鏡觀察結果：

您可以根據需要，選用合適的穿梭載體來裝載目的基因或者目的shRNA。在實際使用過程中，我們采用Clontech配套的慢病毒包裝質粒pSPAX2和pMD2.G(或Invitrogen公司的pLPl 、pLP2 、pLP/VSVG質粒）。

客戶須知:

1. 上述價格均不包括運輸費用。如果您需要干冰運輸，按照30元/公斤干冰計算，一般需要加10公斤干冰，即干冰運輸費用在300元左右。如果采用超低溫冰袋運輸，則運輸費用由AXYBIO公司承擔。我們將采用順豐快遞寄送，全國大部分城市隔天到貨。
2. 如客戶所需包裝的目的基因由客戶提供，則客戶應提供所要構建慢病毒的目的基因的序列及其它相關說明信息（例如裝載載體、質粒圖譜、酶切位點等）?？蛻魬獙λ峁┑牟牧霞靶畔⒇撠?，如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。
3. 如客戶訂購基因過表達的慢病毒，我們承諾交付的慢病毒的滴度不低于10⁷TU/ml，如果低于此滴度，我們將免費重新提供。如果重新提供的病毒還是達不到要求，我們將做退單處理，客戶不需支付任何費用。我們會盡量提供高滴度的慢病毒產品，但考慮到慢病毒包裝對外源表達框的限制，外源表達框較大時，病毒滴度會受到較大影響，因此，如病毒出毒實際滴度介于10⁷TU/ml和10⁸TU/ml之間，我們將按實際滴度出貨。表達shRNA的慢病毒，出毒滴度一般都可以達到10⁸TU/ml。
4. 如果shRNA序列由客戶提供，則本公司只負責證明包含有該shRNA序列的慢病毒構建成功，而不對其干擾效率做任何保證。
5. 如客戶需委托本公司使用包裝好的慢病毒感染目的細胞，建立穩定表達目的基因或目的shRNA的細胞系，則相關實驗費用另外計算。

附：慢病毒包裝和滴度測定流程

1 表達基因用慢病毒包裝載體準備:

編號	服務描述	服務周期
1	客戶選擇目的基因、穿梭載體，AXYBIO公司負責實驗設計	1 – 2 周
2	客戶提供目的基因，或從AXYBIO cDNA庫中購買該基因	1周
3	將目的基因的CDS 區構建至穿梭載體上	2 – 3 周

2 表達shRNA 用慢病毒包裝載體準備:

編號	服務描述	服務周期
1	客戶選擇靶基因或目的shRNA、穿梭載體， AXYBIO公司負責實驗設計	1 – 2 周
2	將目的shRNA 構建至穿梭載體上	2 – 3 周
3	有效shRNA 篩選(三條shRNA，保證至少一條shRNA干擾效率在70%以上)	3 – 4 周

3 質粒準備和轉染

將3或4種質?；旌嫌?5 ml滅菌管中，采用Opti-MEM和Lipo2000進行轉染，轉染方法參考Lipo2000標準PROTOCOL和本公司的實際經驗。

4 收集第一輪的培養基上清

（1）轉染后的細胞CO₂培養箱48 h，37℃，收集上清。
（2）收集的上清，4℃ 8000g離心10 min，除去細胞碎片，0.45 μm PVDF膜過濾。
（3）所得病毒液一部分用于測定病毒滴度，其余可凍存于-80℃。
（4）加入10ml新鮮的DMEM+2%NBS培養基。

5 收集第二輪的培養基上清

（1）加入新鮮培養基后，培養24小時。
（2）收集的上清，4℃ 8000g離心10 min，除去細胞碎片，0.45 μm PVDF膜過濾。
（3）所得病毒液一部分用于測定病毒滴度，其余可凍存于-80℃。

6 病毒的濃縮：離心方法采用差速離心法

（1）病毒上清經0.45 μm濾膜處理，于4℃ 10,000g離心15 min。
（2）上清轉移至另一干凈離心管中，濾液在4℃，40,000g離心2 h。
（3）離心管置于冰浴條件下，用1%體積的DMEM+10% NBS重懸沉淀，重懸時使用同一吸管以避免損失，約每15 s吹打1次，避免產生氣泡。

7 測定病毒滴度（熒光顯微鏡計數）

（1）滴度測定前，以0.5×10⁵濃度種細胞293T于24孔板，每孔1 ml細胞培養基，過夜（12 h）培養使細胞在板底部形成單層，此時細胞密度大約為1.0×10⁵。
（2）取10 μl病毒液+90 μl培養基，依次稀釋得到10^-1至10^-8病毒稀釋液。24孔板依次加入梯度稀釋的待測病毒樣品20 μl，留一孔作為對照不加病毒，培養2天。
（3）熒光計數：熒光顯微鏡下計數帶有熒光的細胞數目
（4）計算病毒滴度：熒光細胞數目×稀釋倍數（10、10²…10⁸）/接種病毒