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        1. 無縫克隆試劑盒(Seamless Cloning and Assembly Kit)

          貨號:A104-5
          規格:10T(50μl)×5支
          保存:-20℃避光保存兩年
          【產品概述】
          基于重組原理的無縫克隆技術,作為新一代的克隆方法,不依賴于繁瑣的酶切、回收、連接等操作,通過DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組,可將DNA片段克隆至任意線性化載體任意位點,載體自連背景極低。無縫克隆技術是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。Seamless Cloning and Assembly Kit作為升級版的無縫克隆及多片段重組試劑盒,一個反應可實現兩個或多個DNA片段的重組,且陽性率高于95%。
          【適用范圍】
          基因定向克隆,多片段重組。
          【實驗流程】

          【ExonArt Seamless Cloning and Assembly試劑盒實驗方案】
          1. 線性化載體制備
          采用酶切或反向PCR擴增方法將載體線性化。
          a. 酶切制備:
          選擇合適的位點,單酶切或雙酶切皆可。若使用單酶切進行線性化,可以適當延長酶切時間以減少環狀質粒殘留。酶切完成后,應將限制性內切酶失活或對線性化載體純化后再用于重組反應。
          注1 : 載體酶切一定要完全,否則未切開的載體會影響后續陽性克隆的鑒定;
          注2 : 經雙酶切進行線性化無需去磷酸化,經單酶切則需要去磷酸化。
          b. 反向PCR擴增制備
          為減少擴增突變的引入,推薦使用高保真的聚合酶進行擴增。推薦使用線性化質粒做模板,以減少環狀質粒模板殘留對后續陽性克隆的鑒定。
          注:如果使用環狀質粒做模板,應使用DpnI對環狀質粒進行降解,再用于后續重組反應。
          2. 插入片段PCR引物設計
          PCR引物的5′ 端必須包含與其相鄰片段(其他插入片段或載體)末端同源的15~25 nt(推薦使用20 nt)序列。
          插入片段正向擴增引物:
          5′-載體上游末端同源序列+酶切位點(可選)+基因特異性正向配對序列-3′
          插入片段反向擴增引物:
          3′- 基因特異性反向配對序列+酶切位點(可選)+載體下游末端同源序列-5′

          注:盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區域進行克隆,當酶切位點25 nt區域內含量為40~60%
          時,重組效率最高。

          1. 插入片段PCR擴增

          推薦使用高保真的聚合酶進行擴增,以減少擴增突變的引入。建議使用純化后的PCR產物進行重組反應。若PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產物,可直接使用,但加樣體積應不超過總反應體積的20%。

          1. 重組反應:

          配制以下反應體系

          組分 反應體系
          Seamless Cloning and Assembly kit 5 μl
          線性化載體 50~200 ng
          插入片段 10~200 ng
          Sterilized ddH2O 補足至10 μl

          重組反應體系配制完成后,用移液槍輕輕吹打混勻各組分后進行瞬時離心,避免氣泡產生,切勿渦旋。

          注1 : 插入片段與載體在重組時為相同摩爾數;

          注2 : 若插入片段的長度小于200 bp,則插入片段與載體的摩爾比應調整為5:1;

          注3 : 當1~2個DNA片段插入載體時,DNA總量推薦為0.02~0.5 pmols;當4~6個DNA片段插入載體時,DNA總量推薦為0.2~1 pmols;

          注4 : DNA摩爾數與質量換算公式:pmols=(weight in ng)×1000/(base pairs×650 daltons) ;例如,200 ng的5000 bp載體為0.06 pmols;

          注5 : 載體片段過長、插入片段過長或片段數過多,克隆數及陽性克隆率均會降低。

          1. 將反應體系置于50℃,反應15~60 min。

          注1:推薦使用PCR儀等溫控比較精確的儀器進行反應,反應時間不足或過長均會影響克隆效率;

          注2:插入片段小于500 bp時,推薦反應時間為15 min;

          注3:插入片段在4 kb以上時,建議反應時間為45~60 min;

          注4:插入3~5個片段時,推薦反應時間為45~60 min。

          1. 重組反應完成后,將反應體系進行瞬時離心,置于冰上冷卻,用于轉化或者凍存于-20℃備用。

          注:-20℃凍存的重組產物,建議在1周內使用。

          1. 重組產物轉化

          取5~10 μl重組產物,加入到100 μl感受態細胞中,緩慢吹打混勻,冰上放置30 min。42℃熱激90 sec,冰上放置3 min,加800 μl SOC或LB培養基,37℃振蕩培養45~60 min。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上,倒置于37℃過夜培養。

          注:不同感受態細胞最后的克隆數及克隆陽性率有所差別,推薦使用轉化效率大于108 CFU/μg的感受態細胞。

          【常見問題】

          1.轉化效率低:感受態效率低下;DNA片段純度不夠;重組反應抑制物;DNA片段比例不佳。

          2.克隆陽性率低:載體線性化不完全;相同抗性質粒污染;平板抗性不足。

          3.大量克隆含有不正確的插入片段:非特異性PCR擴增產物。

          【備注】

          本產品僅供科研使用。在確認產品質量出現問題時,本公司承諾為客戶免費更換等量的合格產品。 在所有情況下,本公司對此產品所承擔的責任,僅限于此產品的價值本身。

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