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        1. 染料法定量PCR MIX(2× SYBR qPCR Master Mix)

          貨號:A101-5
          規格:500rxn(1.0 ml×5支)
          保存:-20℃避光保存兩年
          【產品概述】
          本產品是使用SYBR GreenI 嵌合熒光法進行qPCR的專用試劑。核心組分(包含熱啟動Taq酶,UDG酶, dNTPs, dUTP, Mg2+, SYBRGreenI等)是基于化學法修飾的熱啟動DNA聚合酶,配合針對qPCR優化的反應緩沖液,可以有效抑制非特異性擴增,顯著提高擴增效率,從而對靶基因進行準確定量。同時,本產品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR產物的交叉污染,數據更準確。本產品為2×預混試劑,使用時只需加入模板、引物、ROX? Reference Dye(根據qPCR儀選擇)和水,使其工作濃度為1×,即可進行反應。
          本品特點:使用化學法修飾的熱啟動酶,提高靈敏度,增強特異性;使用dUTP和UDG酶,可有效排除先前擴增產物的交叉污染,數據更準確;針對qPCR優化的反應緩沖液,增強特異性,減少引物二聚體形成,提高擴增效率,重復性好,可信度高;本品不含有用以校準孔間熒光信號差異的ROX Reference Dye,適用于Bio-Rad iCycler CFX96,CFX384,iQ,iQ5,MyiQ,Opticon, Opticon 2,MiniOpticon,Chromo4,Qiagen Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000,Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2s,Roche Applied Science LightCycler 480,Thermo Scientific PikoReal Cycler,Illumina Eco qPCR,Cepheid SmartCycler,Takara TP-800等機型。
          【推薦qPCR反應體系(以20 μl體系為例)】

          Component Volume Final ?Concentration
          2× SYBR qPCR Master Mix 10 μl
          10 μM Forward Primer 0.4 μl 0.2 μM
          10 μM Reverse Primer 0.4 μl 0.2 μM
          50×ROX Reference Dye (If Required) 0.4 μl
          PCR-grade Water Variable
          Template Variable As Required
          Total Volume 20 μl

          反應體系中各成分的量可根據以下原則進行調整:
          反應體系中引物終濃度為0.2μM即可得到較好的擴增效果。當反應性能較差時,引物終濃度可以在0.1 -0.5 μM范圍內進行調整;qPCR靈敏度極高,建立反應體系時加入模板量的準確度對最終結果會有很大的影響。推薦將模板稀釋后加入反應體系中,這樣可以有效提高實驗的重復性;如模板為未稀釋cDNA原液,使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
          【PCR反應條件】

          Step Temperature Duration Cycles
          UDG pre-treatment 50℃ 2 min 1
          Enzyme activation 94℃ 10 min 1
          Initial Denaturation 95℃ 3 min 1
          Denaturation 95℃ 10 sec 40
          Annealing/Extension 60℃ 30 sec
          Melt curve As Required As Required 1

          【注意事項】

          • 本品盡量避免反復凍融,以免酶活下降。如每次使用量較少,推薦分裝后保存
          • 使用前請上下顛倒混勻預混液,預混液經混勻瞬時離心后即可使用
          • 2×SYBR qPCR Master Mix于-20℃保存時,有時會形成沉淀。在室溫短時間放置后,渦旋混勻即可完全溶解。確保試劑混合均勻后再使用
          • 本品含有熒光染料SYBR GreenI,保存以及配制反應體系時應盡量避免強光照射
          • 由于本品檢測靈敏度極高,在配制過程中請使用干凈滅菌槍頭、反應管,條件容許的實驗室推薦使用專用的移液器,避免污染

          【常見問題與解決方案】
          1、陰性對照中有信號產生:
          a) 模板或試劑被核酸污染:在進行PCR反應前采取標準的預防措施,以降低污染風險
          b) 產生引物二聚體:配合融解曲線進行分析
          2、融解曲線出現多個峰:
          a) 存在引物二聚體或其他特殊結構:根據設計原則設計合成新的引物
          b) 引物濃度太高:適當降低引物濃度
          c) cDNA模板帶有基因組污染:重新制備cDNA模板
          3、定量PCR無擴增曲線:
          a) 確認程序中是否設置了信號采集步驟:兩步法擴增程序將信號采集設置在退火延伸階段
          b) 確認引物是否降解:長時間未使用的引物可能發生降解,合成新的引物,重復實驗
          c) 模板濃度太低或降解:減少稀釋度,一般未知濃度的樣品按最高濃度進行檢測
          4、定量PCR擴增曲線不平滑:
          a) 信號太弱:提高模板濃度重復實驗
          b) ROX類型使用錯誤:確認所用ROX與機型是否匹配
          c) 定量PCR反應過程中體積變化:PCR管未蓋嚴導致反應體系蒸發
          5、Ct值出現太晚:
          a) 擴增效率低:優化反應條件,或者重新設計合成引物
          b) 模板濃度太低:減少稀釋度重復實驗,一般未知濃度的樣品按最高濃度進行檢測
          c) 模板降解:重新制備模板,重復實驗
          d) PCR產物太長:推薦PCR產物長度為90-200bp
          【備注】
          本產品僅供科研使用。在確認產品質量出現問題時,本公司承諾為客戶免費更換等量的合格產品。 在所有情況下,本公司對此產品所承擔的責任,僅限于此產品的價值本身。

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